Гуртківець кафедри - учасниця І етапу Всеукраїнського конкурсу студентських наукових робіт з галузей знань і спеціальностей

Гуртківець кафедри КАЩЕНКО ВЛАДИСЛАВА подала для участі у І етапі Всеукраїнського конкурсу студентських наукових робіт з галузей знань і спеціальностей, який проходитиме на факультеті, наукову роботу на тему "ПРИДАТНІСТЬ ЖИРОВОЇ ТКАНИНИ СОБАК ПІСЛЯ ТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ З НЕЇ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН". 

Метою наукової роботи було встановити можливість використання жирової тканини собаки в якості джерела стовбурових клітин, а також на основі індексу проліферації та життєздатності культивованих клітин визначити придатність даного біологічного матеріалу для виділення з нього стовбурових клітин через 72 години після отримання.

Дослідження проводилися в умовах ННЛ «Центр клітинних технологій у ветеринарній медицині» факультету ветеринарної медицини НУБіП України. Жирову тканину отримували з підшкірної клітковини суки, віком 3 роки, якій виконували планову оваріогістеректомію (ветеринарна клініка «Мухтар», м. Переяслав-Хмельницький). З метою асептики, поверхню шкіри перед відбором жирової тканини обробляли 70 % розчином спирту. Тканину відбирали за допомогою стерильного пінцета. Жирову тканину в лабораторію транспортували у конічній пробірці, заповненій 10 мл стерильного фосфатно-буферного розчину, та поміщали в холодильник, де зберігали протягом 3 діб. Отримання культури мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини собаки (МСКЖТС). Для отримання МСКЖТС останню подрібнювали ножицями на фрагменти розміром 4 х 4 мм. З метою дезагрегації жирової тканини її витримували протягом 1 години за температури 37 0C у фосфатно-буферному розчині, який містив 2 мг/см3 колагенази (тип ІІ) та 4 % бичачого сироваткового альбуміну. Співвідношення тканина/розчин становило 1:4. Після цього суміш оброблених ферментом фрагментів жирової тканини додатково дезагрегували за допомогою магнітної мішалки, суспензію дезагрегованої жирової тканини фільтрували за допомогою стерильної марлевої серветки в центрифужні пробірки та центрифугували протягом 10 хв при 600 g. Надосадову рідину видаляли, до осаду клітин додавали поживне середовище (80 % – середовище Ігла, модифіковане Дюльбекко (DMEМ), 20 % – фетальної бичачої сироватки, 10 мкл/мл – антибіотика-антимікотика) та ставили в CO2-інкубатор на культивування при t 37 0C та 5%-му вмісті CO2.
Культивування клітин здійснювали в одноразових пластикових чашках Петрі (d = 30 мм) за стандартною методикою шляхом періодичного їх пасажування після формування моношару на 95–100 %. Підрахунок кількості клітин проводили під мікроскопом при збільшенні у 200 разів в усіх квадратах сітки Горяєва. Дослідження проліферативної активності стовбурових клітин здійснювали з І по ІІІ пасажі, висіваючи їх у чашки Петрі (d = 60 мм) з розрахунку 250 тис клітин/чашку. Індекс проліферації клітин визначали визначали через 24 години після висівання. Життєздатність клітин визначали за допомогою 0,5 % вітального барвника трипанового синього.
Візуальну оцінку та фотографування здійснювали за допомогою інвертованого мікроскопу Axiovert 40 (Carl Zeiss). При статистичній обробці отриманих результатів використовували пакет комп’ютерної програми Microsoft Excel.

Як свідчать результати досліджень, жирова тканина може бути використана у якості джерела стовбурових клітин. При культивуванні суспензії клітин, отриманих із жироовї тканини собаки, встановлено, що колонії клітин почали з’явилятися на 3–4 доби після висівання. Колонії формувалися переважно клітинами у кількості 30–50 шт, які згодом розросталися та зливалися з іншими колоніями, утворюючи суцільний моношар.

 Мікрофотографія колонії стовбурових клітин, виділених із жирової тканини собаки. 3 доба після висівання. Нативний препарат. х300

При цьому клітини рівномірно прикріплювалися по дну чашок Петрі, мали характерну фібробластоподібну морфологію та активно проліферували, формуючи в чашках Петрі на 9 добу після висівання моношар, конфлуентністю близько 90 %. 

 Мікрофотографії стовбурових клітин, виділених із жирової тканини собаки, 9 доба після висівання. Нативний препарат. х200

Пасажування клітин за допомогою 0,25 % розчину трипсину-Версену та висівання їх у нові культуральні чашки сприяло нарощуванню маси клітин, які активно проліферували.
Нами встановлено, що стовбурові клітини, виділені із жирової тканини собаки, володіють значним проліферативним потенціалом, про що свідчать показники індексу проліферації з І по ІІІ пасажі, та високою життєздатністю. Разом з тим, показники індексу проліферації не варіювалися залежно від пасажу, а знаходилися практично на одному рівні. Життєздатність культивованих клітин зростала від 86 % на І пасажі до 94 % – на ІІІ пасажі, що є результатом зниження гетерогенності культури.

Таким чином, жирова тканина собаки може бути використана у якості альтернативного джерела стовбурових клітин. Даний біологічний матеріал придатний для виділення з нього стовбурових клітин навіть через 72 години після отримання, що відкриває перспективи його транспортування на великі відстані.

Ю. Харкевич